研究背景：

干旱是影响全球农作物产量的一种主要非生物胁迫。目前，通过基因工程的手段构建抗旱转基因作物成为应对干旱胁迫的一种重要方法。其中，增强转基因作物抗旱性的一种策略是，将调控非生物学胁迫响应基因的转录因子引进转基因抗旱作物。一类植物特异的转录因子家族AP2（APETALA2），其亚家族DREBs是报道的参与非生物胁迫的早期响应转录因子，主要包含一个AP2结构域，在低温或者缺水条件下可以结合到靶基因的C repeat或脱水响应元件（dehydration response element，DRE）上。已有的报道显示，一些过表达DREBs的转基因植物表现出较强的抗旱性和抗冻性。

丹参是一种传统的中药植物，它的根对于高血脂、脑血管和心血管疾病有很好的疗效。目前，随着环境条件日益恶劣，尤其是全球变暖带来的干旱气候，造成丹参种植范围的缩小和产量的严重下降。因此，提高丹参适应胁迫尤其是干旱胁迫的能力有着非常重要的实际价值。但是，目前通过基因工程改造丹参的研究方向主要聚焦在提高其药用活性成分（如丹参酮）的含量，几乎没有研究应用基因工程来改善丹参适应胁迫的能力。本研究通过在丹参中异源表达拟南芥的DREBs来改善其抗旱性，并通过表型观察和生理学研究、转录组测序分析解析相关抗旱分子机制。

材料方法：

1、 实验材料：

分别选取3株干旱处理6天的51天大小的丹参：p35S::AtDREB1C（组成性启动子CaMV35S驱动拟南芥基因AtDREB1C表达的转基因丹参）、pRD29A::AtDREB1C（胁迫诱导RD29A启动子驱动拟南芥基因AtDREB1C表达的转基因丹参）和WT（野生型丹参），提取RNA，等量混合后构建cDNA文库进行转录组测序。

2、测序方法及数据量：

RNA Seq：Illunima Hiseq 2500 platform，每个样品约5G数据量。

技术路线：

研究结果：

1、 构建转基因植物

为了研究拟南芥基因AtDREB1C在丹参中的作用，构建了两种转基因丹参：p35S::AtDREB1C 和pRD29A::AtDREB1C。其中p35S::AtDREB1C是在组成性启动子CaMV35S驱动下，而pRD29A::AtDREB1C则是在胁迫诱导RD29A启动子驱动下。分别用PCR和RT-PCR对转基因植物进行了验证，从中分别筛选了4个转基因line用于后续研究：p35S::AtDREB1C-01和04，pRD29A::AtDREB1C-02和07。

2、转基因丹参中AtDREB1C表达模式

用RT-PCR方法检测在外源ABA处理和各种胁迫处理条件下，转基因丹参中AtDREB1C的表达情况。实验结果显示，无论是在对照组还是处理组，在p35S::AtDREB1C的两个lines中，AtDREB1C都呈现出较高的表达量；而在pRD29A::AtDREB1C的两个lines中，在对照组AtDREB1C表达量非常低，在处理组AtDREB1C受到很强的诱导表达。

3、转基因丹参的表型变化和抗旱性分析

通过观察正常生长条件下转基因丹参、野生型（WT）、转基因对照（转化pCAMBIA3301空载体），发现p35S::AtDREB1C的两个lines比对照植物生长缓慢，而pRD29A::AtDREB1C的两个lines生长并没有受到影响。p35S::AtDREB1C植物株高比WT矮三分之一，叶片颜色变深，叶片较短较小。

通过观察在干旱处理条件下转基因丹参和WT的表型，从而检测在丹参中表达AtDREB1C是否能增强抗旱性。在干旱处理早期（处理3天），所有植物都表现出正常生长状态。在干旱处理6天时，WT和转基因对照植物的叶片迅速萎蔫，而转基因丹参则没有变化。在干旱处理9天时，WT和对照植物严重萎蔫，而转基因丹参几乎没有变化。在干旱处理晚期（处理11天），所有的植物，包括转基因丹参，都表现出严重的萎蔫。在恢复供水以后，转基因丹参p35S::AtDREB1C和pRD29A::AtDREB1C都迅速恢复了，而WT和转基因对照则不能恢复生长，最终死亡。

图1 转基因AtDREB1C丹参表型分析

4、异源表达AtDREB1C可降低干旱胁迫下ROS的积累

一般干旱胁迫会引起植物ROS的积累，因此分析在干旱胁迫下转基因丹参是否可以减少ROS的积累。通过NBT和DAB染色方法检测干旱胁迫下植物体内O2- 和H2O2。在正常生长条件下，WT和转基因对照都没有检测到NBT染色，在干旱处理下，可以看到明显的NBT染色。但是即使在干旱胁迫下，在AtDREB1C转基因丹参中也没有检测到NBT染色。此外，相对WT和转基因对照，AtDREB1C转基因丹参中也没有检测到明显的DAB染色。O2- 和H2O2的定量分析结果显示，在AtDREB1C转基因丹参中ROS含量显著性低于WT。

图2 WT和转基因丹参叶片中O2- 和H2O2分析

5、表达AtDREB1C影响MDA含量和SOD、POD、CAT活性

我们还检测了在WT和转基因丹参叶片中一个脂质过氧化作用的标志物质MDA的含量。在干旱处理9天时，转基因丹参中MDA含量明显低于WT和转基因对照。进一步通过检测SOD、POD和CAT（清除胁迫时植物积累的有害ROS的抗氧化酶）的活性来分析转基因丹参的抗旱机制。分析结果显示，在9天干旱处理过程中，这些抗氧化酶的活性在各植物中趋势类似。在AtDREB1C转基因丹参中，所有抗氧化酶的活性都要显著高于WT和转基因对照。这些结果说明，AtDREB1C转基因丹参的抗旱性增强可能与其减少的MDA含量和增强的抗氧化酶活性相关。

6、过表达AtDREB1C增加了转基因丹参中RWC和叶绿体含量

我们检测了干旱处理9天时植物体内的RWC和叶绿素含量。AtDREB1C转基因丹参的RWC含量高于WT和转基因对照，p35S::AtDREB1C和pRD29A::AtDREB1C之间没有显著差别。tDREB1C转基因丹参的叶绿色含量也显著高于WT和转基因对照，p35S::AtDREB1C的叶绿色含量最高。

7、干旱胁迫下AtDREB1C转基因丹参光合作用能力增强

为了评估转基因丹参的光合作用能力，我们用CIRAS-2方法检测干旱处理下植物的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（E）和叶片的气孔导度（gs）。正常生长条件下，在所有材料中这些值均没有显著差异。在干旱处理下，WT和转基因对照Pn、E和gs值都显著下降，但是AtDREB1C转基因丹参的受到的影响没这么大。在干旱处理9天时，这些参数差异最显著，但是p35S::AtDREB1C和pRD29A::AtDREB1C没有显著差别。

8、干旱胁迫下过表达AtDREB1C转基因丹参转录组测序分析

为了进一步解析AtDREB1C转基因丹参抗旱的分子机制，我们通过对p35S::AtDREB1C、pRD29A::AtDREB1C和WT进行转录组测序进而分析转录组基因表达变化。对p35S::AtDREB1C、pRD29A::AtDREB1C和WT，分别提取3株干旱处理6天的51天大小植物提取RNA，等量混合后构建cDNA文库进行转录组测序。对转录组数据进行de novo组装，得到13,153,489条contigs，161,844个转录本和73,748个unigenes。

通过对1,970个差异表达基因（DEGs）进行聚类分析发现，其中704个差异基因在两个差异分组（WT vs p35S::AtDREB1C，WT vs pRD29A::AtDREB1C）中表达都类似。相对WT，在p35S::AtDREB1C中629个unigenes上调351个下调表达，在pRD29A::AtDREB1C中1,148上调378个下调表达。相对于p35S::AtDREB1C，在pRD29A::AtDREB1C中342上调101个下调表达。

为了对转录组数据进行验证，选择了30个差异表达基因（18个上调，12个下调）进行定量RT-PCR实验验证。实验结果显示，基因的表达模式与转录组测序基因表达模式相类似。相关性分析显示，RNA测序数据和qRT-PCR数据之间呈现较高的相关性（R2〉0.98），这进一步验证了RNA测序数据的可靠性。

 

图3 WT和AtDREB1转基因丹参的差异基因聚类分析

图4 两组差异分组（WT vs p35S::AtDREB1C　WT vs pRD29A::AtDREB1C）韦恩图

9、差异表达基因的COG富集和KEGG通路分析

通过对DEGs在COG数据库进行注释和分类分析，基于注释在COG每个分类中的基因数目进行排名，发现在两个差异分组的DEGs中，“转录本”和“信号转导机制”都排在前三类中。这说明在这两个分类中的差异基因在转基因丹参抗旱中发挥重要作用。

我们还用KEGG数据库对DEGs进行基因功能和调控通路分析。分别获取了两个差异分组（WT vs p35S::AtDREB1C，WT vs pRD29A::AtDREB1C）DEGsD的KEGG富集的前50个代谢通路。在两组中均富集的KEGG通路有光合作用、

植物激素信号转导、核糖体、苯丙素生物合成。其中植物激素调控途径分别位于两个差异分组KEGG富集结果的第二和第四。具体分析各植物激素途径发现，生长素、赤霉素、油菜素内酯、茉莉酸和水杨酸的途径中，两个差异分组的DEGs均上调表达；乙烯途径中的差异基因则表现出混合表达模式，如ERF1/2；脱落酸途径中的差异基因表现出各种表达模式，如在p35S::AtDREB1C中PP2C下调SnRK2上调，在pRD29A::AtDREB1C中PP2C为混合表达模式，PYR/PYL和SnRK2上调。

图5 差异基因的COG和KEGG分类分析

此外，还分析了干旱处理下p35S::AtDREB1C和pRD29A::AtDREB1C的差异基因DEGs。根据COG数据库注释，约15%的DEGs为“次生代谢生物合成转运和分解代谢”。KEGG富集结果显示，“苯丙氨酸代谢”和“苯丙素生物合成”位于前两位。相对于p35S::AtDREB1C，大多数DEGs在pRD29A::AtDREB1C中上调表达。

图6 植物激素信号转导相差异基因的KEGG通路分析

创新点：

1、丹参是一种传统的中药植物，它的根对于高血脂、脑血管和心血管疾病有很好的疗效。提高丹参适应胁迫尤其是干旱胁迫的能力有着非常重要的实际价值。

2、目前通过基因工程改造丹参的研究方向主要聚焦在提高其药用活性成分（如丹参酮）的含量，几乎没有研究应用基因工程来改善丹参适应胁迫的能力。本研究通过在丹参中异源表达拟南芥的DREBs来改善其抗旱性。

3、表型数据丰富，文章分别从植物形态、ROS含量、MAD含量、清除ROS的酶（CAT等）、光合作用相关参数、RWC和叶绿体含量，分析比较了转基因丹参和WT的抗旱性。

4、转录组数据分析紧密与抗旱的表型数据相结合，从DEGs的COG和KEGG注释和富集分析的结果来解析转基因丹参抗旱的分子机制。

参考文献

Modulating AtDREB1C Expression Improves Drought Tolerance in Salvia miltiorrhiza[J].Frontiers in Plant Science，2017.