漫谈16S的前世今生

本文转载自“微微悦明”,已获授权。本人对内容有编辑和修改。 16S的基础概念 16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟,其种类少,含量大(约占细菌RNA含量的80%),分子大小...

本文转载自“微微悦明”,已获授权。本人对内容有编辑和修改。

16S的基础概念

16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟,其种类少,含量大(约占细菌RNA含量的80%),分子大小适中,存在于所有的生物中,其进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝,5S、16S、23S rDNA的拷贝数相同。16S rDNA由于大小适中,约1.5Kb左右,既能体现不同菌属之间的差异,又能利用测序技术较容易地得到其序列,故被细菌学家和分类学家接受。

关键词:普遍、保守、大小适中、可变区!

1、16S rRNA 普遍存在于原核生物中。 rRNA 参与生物蛋白质的合成过程,其功能是任何生物都必不可少的,而且在生物进化的漫长历程中保持不变,可看作为生物演变的时间钟。

2、在 16S rRNA 分子中,既含有高度保守的序列区域,又有中度保守和高度变化的序列区域,因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。

3、16S rRNA 的相对分子量大小适中,约 1540 个核苷酸,便于序列分析。

4、可变区序列因细菌不同而异,恒定区序列基本保守,所以可利用恒定区序列设计引物,将16S rDNA片段扩增出来,利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。

16S的结构

16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区,保守区序列反映了物种间的亲缘关系,而可变区序列则能体现物种间的差异。

16S拥有9个可变区域,其结构和分布,如下图所示:

image

图1. 引物与16S可变区的相对位置[8]

image

图2. 嗜酸乳杆菌16S为例展示引物和可变区位置[8]

基于16S全长的菌种鉴定(一代测序)

工作对象:已培养的纯菌落

所用技术:一代测序仪3730

工作流程:

核酸提取-->基因扩增-->产物纯化化-->测序反应-->序列比对

核酸提取
基因扩增
产物纯化
测序反应
序列比对

16S全长常用引物序列:

8FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492RGGTTACCTTGTTACGACTT
sgFAGAGTTTGATCATGGCTCAG
sgRTAGGGTTACCTTGTTACGACTT

试剂成本: <100元

优点:可辅助常规菌种鉴定方法,如显微形态和培养特征以及理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等方法,提高菌种鉴定的准确度。

缺点:仅能用于纯菌!仅能用于纯菌!仅能用于纯菌!

基于16S的菌群结构分析(二代测序)

工作对象:临床样本(如粪便、脑脊液、血液、尿液等)、环境样本(土壤、污水等)

所用技术:二代测序仪,如Illumina的Hiseq和Miseq、Thermo的Ion Torrent,以及Roche的454(已停产)

工作流程:

基因组DNA-->样本质控-->PCR扩增建库-->文库质控-->illumina Hiseq2500/Miseq测序-->原始数据-->数据质控-->高质量数据-->生物信息学分析

部分常用引物序列:Table 1. Primer selection table for specific 16S rRNA gene region to be amplified.

image

V4515FGTGYCAGCMGCCGCGGTAA
V4806RGGACTACNVGGGTWTCTAA
V3-V4341FCCTACGGGNGGCWGCAG
V3-V4805RGACTACHVGGGTATCTAATCC

试剂成本:~ 100 ~ 400元/样本,由使用耗材等级、人力成本决定。

优点:通过检测16S rDNA的序列变异和丰度,反映样本中细菌的分类和丰度,获得样本物种分类,物种丰度,种群结构,系统进化,群落比较等诸多信息,可用于临床样本的未知病原菌检测。

缺点:(1)受限于二代测序的读长,目前只能最多测16S九个可变区中的2个,一般为V3-V4区。因此对菌群的分辨率,部分菌种只能分辨到属水平。

(2)缺少SOP实验方案。不同实验因素对实验结果影响较大。详情可参照前贴 【好文共赏】宏基因组实验的那些坑-16S扩增子建库方法的各影响因素

(3)相较于WGS宏基因组测序,16S宏基因组也可用于功能学方面研究,但不准确。详情可参照前贴 微微,我想测个序啊(宏基因组篇)

16S的未来:三代测序

读长短分辨率低咋办?上三代测序啊!

Pacbio测序技术用于16S宏基因组,已有相关的文献发表

参考文章:High-resolution phylogenetic microbial community profiling 附图2

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一次上机测通9个可变区,分辨率高,准确度高,更适用于临床样本中未知病原检测和其他科学研究应用。

可惜,由于未解决样本pooling等原因,其价格居高不下,目前还在八千元一个样本的水平,高昂的费用极大的制约了科研人员使用的积极性。

此外,新近进入中国市场的Nanopore目前尚未由应用于16S的实际案例出现。相较于Pacbio,Nanopore测序技术在灵活度方面更胜一筹,是否能用于16S相关研究,笔者对其报以极大的期待。

Reference

  1. Illumina官方16S建库手册 https://www.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf
  2. Caporaso JG,et al. 2011. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (Suppl):4516–4522. doi:10.1073/pnas.1000080107.
  3. Parada AE, et al. 2015. Every base matters: assessing small subunit rRNA primers for marine microbiomes with mock communities, time series and global field samples. Environ Microbiol. doi:10.1111/1462-2920.13023.
  4. Apprill A, et al. 2015. Minor revision to V4 region SSU rRNA 806R gene primer greatly increases detection of SAR11 bacterioplankton. Aquat Microb Ecol 75:129–137. doi:10.3354/ame01753.
  5. Jiang, H., et al. 2006. Microbial Diversity in Water and Sediment of Lake Chaka, an Athalassohaline Lake in Northwestern China. Applied and Environmental Microbiology. 72 (6): 3832-3845. doi:10.1128/AEM.02869-05.
  6. Walker, A.W., et al. 2015. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome 3:26. doi: 10.1186/s40168-015-0087-4.
  7. Muyzer, G. et al. 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 59:3 695-700.
  8. http://omegabioservices.com/index.php/16s-reference/
  9. https://teachthemicrobiome.weebly.com/sequencing-the-microbiome.html

以上部分资料参考于网络,并感谢宏基因组讨论群各位老师提供相关资源,在此致谢。

  • 发表于 2017-12-18 23:07
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  • 分类:其他组学

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