小编在此主要介绍一下一篇文献中叶绿体组装策略，毕竟现在好多植物完成测序，从里面捞点叶绿体数据自己组装发篇小文章还是可以的，嘻嘻。

背景

第二代测序虽然也能完成对整个基因组序列完成测序，但其短的读长以及GC偏好性导致基因组组装仍然是不够理想的。而PacBioRS测序平台（现在貌似开始兴Sequel）能够明显增加测序读长以及均匀的覆盖度，使得基因组组装质量显著提高。此文主要介绍PacBioRS测序平台在在蕨麻(Potentilla micrantha)叶绿体基因组组装中优势。同时也介绍了利用illumina数据组装叶绿体的方法。

结果

纠错后,总共28638PacBio RS分子，平均读长1,902bp,总的数据量54,492,250bp,平均深度报道320×。经过三代组装产生一条contig，完全覆盖整个154,959bp叶绿体基因组;而illumina组装出7条contig，覆盖度只有90.59%。

结论

这是第一篇利用PacBio进行叶绿体基因组组装。PacBioRS组装出一条contig，且精确度高于Illumina组装结果。

下面主要介绍一下方法了

一、   illumina（没钱人的方法）

1、 获取本物种基因组测序原始数据，使用NCBI UniVec数据库去除污染的序列。

2、使用SMALT软件将去除污染后数据比对到该物种几个同源物种的叶绿体基因组Fragaria vesca (EMBL accession JF345175), Malus ×domestica(http://www.rosaceae.org),Nicotiana tabacum(EMBLaccession Z00044), Glycine max (EMBL accession DQ317523),Medicago truncatula (EMBL accession AC093544),Prunus persica (EMBL accession HQ336405),Populusalba (EMBL accession AP008956) and Solanum lycopersicum(EMBL accession AM087200) ；相似度超过90% 的read保留。

3、Quality trimming。使用此软件 Sickle (https://github.com/najoshi/sickle), q= 30，l = 50 参数进行质控。

4、 质控后数据使用AbySS组装。奇数k-mer： 19, 21, 25, 27, 31, 33, 39, 41, 45, 47, 51, 53, 59,61,65, 67, 71, 73, 77, 81，统统试了一遍，选取组装效果好的。

5、组装结果使用 CD-Hit聚类，参数为 100% to remove redundant；unique contigs 使用minimus2合并

6、 IRs区域人工校正来实现一条contig两端含有互补的 IRs 。

二、三代组装叶绿体（有钱人做法）

1、使用HGAP（SMRT Analysis version 1.4 ）纠错。 

2、使用 BLAT获取叶绿体的read。注 SMALT不能操作长的带有错误的read. 具体抽取方法同illumina，也是跟同源物种的叶绿体比对。 

3、纠错后使用 Celera Assembler组装

4、组装后使用minimus2 （AMOS 3.1.0 assembly package）进行合并 

5、 IRs区域人工校正来实现一条contig两端含有互补的 IRs 。

参考文献

Ferrarini, M., Moretto, M., Ward, J. A., Šurbanovski, N., Stevanović, V., & Giongo, L., et al. (2013). An evaluation of the pacbio rs platform for sequencing and de novo assembly of a chloroplast genome. BMC Genomics, 14(1), -.